1991年，18岁的格温妮斯·帕特洛在史蒂文·斯皮尔伯格执导的奇幻冒险电影《铁钩船长》中饰演少女时期的温蒂  。1993年，主演爱情悬疑电影《无情大地有情天》，她凭借该片获得美国国家影评人协会奖最佳女配角奖；同年，与妮可·基德曼合作出演惊悚犯罪电影《体热边缘》  。

1994年，与詹妮弗·杰森·李、坎贝尔·斯科特等联合出演传记电影《派克夫人的情人》；同年，与尼克·诺特合作主演爱情传记电影《杰弗逊在巴黎》  。

1995年，与布拉德·皮特、摩根·弗里曼联合主演剧情电影《七宗罪》，在片中饰演年轻貌美、温柔体贴的妻子翠茜·密尔斯，她凭借该片入围第22届土星奖最佳女配角奖。1996年，与杰瑞米·诺森搭档主演爱情喜剧电影《艾玛》，在片中饰演出身高贵、漂亮且性格开朗的艾玛  ；同年，与大卫·休默合作主演爱情喜剧电影《出殡抱佳人》  。

1998年，与约翰·林奇、约翰·汉纳联袂主演爱情电影《滑动门》，在片中饰演一家公司做公关工作的海伦·奎利  ；1月，与伊桑·霍克共同主演的爱情电影《烈爱风云》上映；6月，与迈克尔·道格拉斯合作主演的犯罪电影《超完美谋杀案》上映，她在片中饰演富豪史帝芬·泰勒的妻子艾蜜莉  ，她凭借该片获得百仕达娱乐奖最受欢迎女演员奖（悬疑类）；同年，与约瑟夫·费因斯搭档主演爱情电影《莎翁情史》，她在片中饰演不顾当时女人不能粉墨登场的禁令，假扮成男人的薇拉夫人，凭借该片获得第56届金球奖电影类-音乐喜剧类最佳女主角奖、第71届奥斯卡金像奖最佳女演员奖  。

1999年，与马特·达蒙合作主演惊悚犯罪电影《天才雷普利》  。2000年，与本·阿弗莱克共同主演爱情电影《机票情缘》，在片中饰演老实人格里格的遗孀艾比；同年，由其出演的喜剧电影《风情万种》上映  。

2001年，与杰克·布莱克搭档主演爱情喜剧电影《庸人哈尔》，在片中饰演自卑胆小，不受男人欢迎的独生女罗丝玛丽·夏纳罕；同年，与吉恩·哈克曼、安杰丽卡·休斯顿联合主演剧情电影《特伦鲍姆一家》，在片中饰演爱瑟莲·特伦领养的养女玛葛·特伦。

2002年，出演由杰伊·罗奇执导的动作喜剧电影《王牌大贱谍3》  ；同年，与艾伦·艾克哈特、杰瑞米·诺森联袂主演爱悬疑电影《无可救药爱上你》，她在片中饰演才华横溢但又有点因循守旧的书呆子型女学者毛德·贝丽  。

2003年，与丹尼尔·克雷格共同主演传记电影《瓶中美人》  ；同年，与迈克·梅尔斯共同主演爱情喜剧电影《美国空姐》  。2004年9月17日，与裘德·洛、安吉丽娜·朱莉联袂主演动作惊悚电影《天空上尉与明日世界》。

2005年，与安东尼·霍普金斯、杰克·吉伦哈尔联合出演剧情电影《证据》，她在片中饰演数学家罗伯特的女儿，精神压抑并伴有恐惧症的凯瑟琳  ，她凭借该片入围第63届金球奖电影类-剧情类最佳女主角奖  。

2006年，出演由瑞恩·墨菲执导的喜剧电影《夹缝求生》  ；10月13日，与托比·琼斯、西格妮·韦弗联合出演的传记电影《声名狼藉》上映  。2007年，与佩内洛普·克鲁兹、马丁·弗瑞曼等联袂主演爱情喜剧电影《晚安好梦》  ；4月25日，由其出演的爱情电影《相思成灾》上映  。

2008年，与小罗伯特·唐尼等联合出演科幻动作电影《钢铁侠》，在片中饰演精明能干、性感迷人的女助手“小辣椒”维吉尼亚波茨，她凭借该片入围第35届土星奖最佳女主角奖。2009年2月13日，与杰昆·菲尼克斯合作主演的爱情电影《两个情人》上映，她在片中饰演美丽的金发女郎米歇尔，她凭借该片入围美国独立精神奖最佳女主角奖，获得佛罗里达影评人协会奖最佳女演员奖。

2010年，与加内特·赫德兰合作主演音乐题材电影《乡谣情缘》，她在片中饰演沉浮不定的乡村音乐大明星凯莉，与一位年轻的作曲家一同筹办自己的演唱会  ；5月7日，由其出演的电影《钢铁侠2》上映  ，她凭借该片入围第12届青少年选择奖最佳科幻电影女演员奖。

2011年2月27日，她作为表演嘉宾出席第83届奥斯卡颁奖礼，演唱她的入围歌曲《回家》（《乡谣情缘》的主题曲）  ；同年，与玛丽昂·歌迪亚、马特·达蒙联合出演剧情电影《传染病》。2012年，与小罗伯特·唐尼、克里斯·埃文斯联合出演科幻动作电影《复仇者联盟》。

2013年，由其出演的电影《钢铁侠3》上映  ，她凭借该片入围第15届青少年选择奖最佳动作电影女演员奖；同年，由其参演的电视剧《欢乐合唱团第五季》首播；9月，与马克·鲁弗洛、蒂姆·罗宾斯联合主演的爱情喜剧电影《感谢分享》上映。

2014年，出演电视剧《网疗记第四季》。2015年，与约翰尼·德普共同主演动作喜剧电影《贵族大盗》  ，她凭借该片入围第36届金酸莓奖最差女主角奖  ；8月21日，在《福布斯》公布的全球最高薪女星排行榜中，以年收入900万美元，排第12名。

2017年，出演由乔·沃茨执导的科幻动作电影《蜘蛛侠：英雄归来》  ；同年，与安东尼奥·班德拉斯合作主演传记电影《33天》。2018年，出演电影《复仇者联盟3：无限战争》。2019年，由其出演的电影《复仇者联盟4：终局之战》上映  ；同年，与本·普拉特主演电视剧《政客第一季》。2020年，由其出演的电视剧《政客第二季》播出。